近几十年来乳腺癌治疗取得了巨大的进展，但该病的全球发病率和死亡率仍居于高位。即使有了增强成像检测和组织活检能力，在通过标准的反应评估方法（包括广泛用于评估治疗反应和治疗获益的RECIST 1. 1标准）获得信息之前，疾病可能已因无效治疗进展。而循环生物标志物的采集频率可以高于成像或组织采样，其或许可以为乳腺癌领域带来更有效的癌症管理方法。 CEA, CA15-3, CA27-29 癌胚抗原（CEA）是一种参与细胞粘附的糖蛋白，在许多癌症中均可升高。CA15-3和CA27-29是跨膜糖蛋白MUC-1的含碳水化合物的蛋白抗原，似乎可抑制肿瘤细胞裂解，减少细胞间相互作用。 有研究显示诊断时血清 CA15-3 值升高与更高的乳腺癌分期、肿瘤大小、阳性腋窝淋巴结以及更差的OS和DFS相关。但在早期乳腺癌中，血清肿瘤标志物水平升高不明显，敏感性较差 (<7%) 并且缺乏确定它们在早期疾病中的应用效果的前瞻性随机对照试验证据。 而在转移性乳腺癌（MBC）中，血清肿瘤标志物敏感性较高。研究显示CEA、CA15-3 和 CA27-29在MBC中的敏感性分别为 62.8%、82.8% 和 85.7%。许多研究对血清肿瘤标志物进行了连续测量，评估了它们在早期发现疾病进展和监测治疗反应方面的应用。值得注意的是，有研究显示，在MBC患者中，从CA15-3水平增加>30 u/mL到影像学确诊进展中位提前期为9个月。CEA、CA15-3和CA27-29在MBC中具有预后和预测意义，并在治疗反应的系列监测中显示出价值。 目前正在进行随机对照试验比较CEA、CA15-3、CA27-29标志物的疾病监测与传统的基于影像学的监测。通过与现行标准的基于影像学的监测建立非劣效性，或许可以潜在地增加CEA、CA15-3和CA27-29的临床意义。 HER2 ECD HER2基因编码一种分子量为185 kDa糖蛋白受体（HER2蛋白），具有内在酪氨酸激酶活性。HER2已被证明在20%-30%的乳腺肿瘤中扩增，这种基因扩增与患者的无病生存期（DFS）和总生存期（OS）下降相关。组织HER2已被确定为抗HER2治疗反应的预后和预测生物标志物。NCCN和ASCO指南建议在乳腺癌诊断时及易于活检的新诊断的转移瘤中评估HER2的免疫组化表达水平，以指导治疗。HER2/neu蛋白有3个结构域，包括一个105 kDa的胞外域（ECD），它从肿瘤细胞中脱落，并可以在血清中定量。部分研究建立了血清HER2和组织HER2表达之间的相关性，但其他研究则未显示两者相关。由于结果并不统一，因此目前血清HER2 ECD不能替代组织HER2状态测定。 GP88 目前单独使用血清生物标志物识别疾病进展和治疗反应的临床应用有限。因此，需要寻找可作为疾病和肿瘤发生驱动因素的循环生物标志物，或许可以通过此类标志物监测实时生物过程。例如GP88，前颗粒蛋白，一种88 kDa糖蛋白，是从PC细胞系中分离出的富含半胱氨酸的多肽生长调节剂69、70家族中最大的成员。临床前研究发现GP88是细胞增殖、存活和侵袭性的生物学驱动因子，与耐药性相关。此外，抑制PC细胞和人乳腺癌细胞系中GP88的表达可以显著抑制肿瘤发生。考虑到这些效应，GP88是乳腺癌研究中的一个有吸引力的标志物。 在几项研究中评价了GP88肿瘤组织表达，发现其具有预后相关性，并与肿瘤组织学分级、DFS、OS、淋巴结状态和肿瘤大小相关。并且在所有分期的乳腺癌患者中，GP88的循环水平均高于健康受试者。此外，一项在697例接受原发性乳腺癌根治性手术患者中进行的研究显示术前血清GP88值升高与复发相关。 目前临床实践中的血清GP88已被证明在监测MBC的治疗反应中更有用。Tkaczuk等人在101例MBC患者中连续测定GP88和CA15-3，结果显示与GP88＞55ng/mL的患者相比，GP88＜55ng/mL的患者OS增加了4倍。此外，CA15-3与疾病进展显著相关，但与治疗反应无关，而GP88与两者显著相关。GP88作为肿瘤发生驱动因子的新型靶标，其在癌症领域中的探索令人兴奋，更多相关研究正在进行中。 CTC CTC是肿瘤原发灶或转移灶脱落释放到体液中的肿瘤细胞。 CTC计数已被用于早期乳腺癌的预后判断。一项对487例乳腺癌患者血液样本进行的前瞻性研究显示在56%的患者中检测到CTC，其中83%为IV期患者。样本CTC计数超过10个与OS缩短相关。其他大型多中心研究已经确定，初次诊断时CTC升高与DFS和OS缩短相关，化疗完成后5年出现CTC是无复发生存（RFS）不良的预后因素。有趣的是，Goodman等人的一项回顾性研究表明，早期乳腺癌患者术后CTC检测可预测辅助放疗的获益。这些结果需要在前瞻性干预性试验中验证，但它们说明了CTC检测乳腺癌微小残留病(MRD)或隐匿性微转移的潜力。 在MBC中，CTC也被确定为独立的预后因素。在对2436例MBC患者的汇总分析中，研究者根据CTC计数将患者分为Ⅳ期侵袭性（≥5个/7.5mL）和Ⅳ期惰性（＜5个/7.5 mL）。独立于临床和分子变量，IV期惰性患者的OS长于IV期侵袭性患者（36.3个月 vs 16.0个月）。另外一项研究证明，CTC是比影像学更能体现疾病状态的指标，影像学无进展和≥5个CTC的MBC患者的OS短于影像学无进展和<5个CTC的患者。有影像学进展证据的患者的中位OS趋势相似。这些研究使得CTC成为MBC的预后生物标志物，并表明了其相对于传统成像方法的优势。 CTC的一个有前景的应用是检测MBC治疗缓解或失败。SWOG S0500研究探索了改变化疗是否可改善CTC并持续升高患者OS。具体而言，在根据CTC水平开始新的化疗线之前，将595例患者分为三组，其中C1、C2组为CTC持续升高的患者。然后这些患者被随机分配继续初始治疗（C1组）或改为替代治疗（C2组）；虽然CTC在三组之间具有很强的预后性，但C1和C2之间的中位OS无显著差异。因此研究者得出结论，结果可能反映了C1、C2组患者现行的治疗均无法满足需求，需要更有效的治疗方案，而不是CTC未能检测到无效治疗。STIC CTC是一项多中心前瞻性试验，将761例MBC患者随机分配至先验临床组（临床低危给予激素治疗、临床高危化疗，由医生决定，此时并不知道CTC结果）或CTC驱动组（如果CTC<5/7.5 mL，则给予激素治疗，如果CTC≥5/7.5 mL，则给予细胞毒性化疗）。CTC驱动组的PFS不劣于安慰剂组。有趣的是，临床低危／CTC高危亚组，选择化疗患者比选择内分泌治疗患者的PFS明显延长[15.6 月（95%CI 12.2-22.7个月）VS 10.5月（95%CI 7.3-15.4个月），P=0.002]。本试验说明CTC具有指导治疗的潜力，并强调了需要额外的研究进行进一步探索。 ccfDNA 循环游离核酸（ccfDNA）可以进一步分析表观遗传改变，包括DNA甲基化。与转移性疾病中的预后或治疗监测标志物相比，ccfDNA 甲基化作为原发性乳腺癌的诊断生物标志物被更广泛地研究。 单个基因或一组基因都被证明可以区分健康患者和具有不同敏感性和特异性的乳腺癌患者。一项荟萃分析显示，ccfDNA中APC基因甲基化检测乳腺癌的灵敏度较低（20%），但特异性较高（96%）。而其他研究显示至少2个基因的甲基化组产生的灵敏度更高，其中Kim等和Radpour等的研究显示其2和8基因甲基化组分别为94.1%和90%。值得注意的是，Yamamoto等人开发的3基因甲基化组在早期乳腺癌中的灵敏度高于血清标志物CEA和/或CA15-3。ccfDNA甲基化有希望成为乳腺癌标准诊断标志物，当然还需要进一步的研究来就基因panel的选择及收集方法达成共识。 在预后方面，几项研究表明，各种启动子位点的 ccfDNA 甲基化与较差的存活率相关。并且过去很少有研究评估ccfDNA甲基化在监测和预测原发性乳腺癌的治疗反应中的应用，需要采用一致的甲基化方法和终点进行更大规模的前瞻性试验，以充分评估 ccfDNA 甲基化的预测潜力。 在晚期乳腺癌领域， Fackler和 Visvanathan 等人开发了一种血清DNA甲基化测定方法预测 MBC的预后，基线和第4周累积甲基化指数升高导致PFS和OS更差。此外，从基线到第4周的累积甲基化指数增加与更差的PFS和首次重新分期时的疾病进展相关。并且他们在最近开发了一个9基因甲基化panel，该panel采用基于自动试剂盒的技术，即GX乳腺癌监测检测，初步证明其灵敏度为85%，特异性为92%。此外，Panagopoulou 等人建立了5基因ccfDNA甲基化组，≥3和≥4个基因的甲基化分别与较差的OS和无药物治疗反应相关。利用机器学习和统计分析，他们开发了用于预测化疗反应和转移性疾病OS的模型，该模型使用 ccfDNA 水平和 ccfDNA 甲基化作为参数。这展示了自动化机器学习等新技术在开发和选择用于前瞻性研究的panel中的应用，并且这项技术在该领域日益普遍。 在原发性乳腺癌和转移性乳腺癌中，启动子位点的 ccfDNA 甲基化是一种很有前途的工具，在诊断、预后和监测治疗中具有潜在的应用。鉴于产量低，检测和量化 ccfDNA 的甲基化部分是一项特别的挑战，但随着自动化机器学习等新技术开发和选择用于前瞻性研究的panel，我们也许能够达成推进 ccfDNA 甲基化研究所需的共识。 ctDNA 由于乳腺癌的异质性，在肿瘤发生过程中涉及多个突变，因此 ctDNA 分析在乳腺癌的筛查和诊断中作用不大。然而，ctDNA水平与肿瘤负荷直接相关。 在预后方面，ctDNA 的存在与早期乳腺癌的不良预后相关。Radovich 等人在TNBC患者（n=196）中比较了ctDNA和CTC在预测疾病复发方面的作用。研究显示可检测到ctDNA与24个月时较差的 DDFS、DFS 和 OS 显著相关，并且ctDNA和CTC的组合提高了敏感性和鉴别能力。但由于目前缺乏前瞻性试验和检测方法的共识，ctDNA作为预后生物标志物在早期疾病中广泛使用的潜力有限。 在晚期乳腺癌中，与早期乳腺癌相同，ctDNA水平与MBC较差OS率相关，连续测量 ctDNA有可能监测和预测治疗反应。概念验证分析显示，与 CA15-3 和 CTC 相比， ctDNA 水平升高在预测疾病进展方面更敏感。此外，研究证明通过连续 ctDNA 测量可以成功监测Palbociclib联合氟维司群的治疗。目前，PADA-1研究正在探索通过ctDNA水平变化改变治疗方案是否可行，研究者们在接受 Palbociclib 联合芳香酶抑制剂治疗的 HER2 阴性 MBC 患者中进行连续ESR1 ctDNA测量，将ESR1 ctDNA 水平升高的患者随机分为两组，一组治疗方案改为palbociclib联合氟维司群的治疗，另一组仍然维持原治疗方案并在疾病进展后二线治疗改用palbociclib联合氟维司群。结果显示在出现ctDNA水平升高后更换治疗方案的患者更换治疗方案后的PFS高于继续治疗组继续治疗后的PFS与二线治疗PFS之和。该研究显示了通过ctDNA 监测来提前干预治疗的有效性。 除了量化之外，ctDNA 还可以确定特定基因的突变状态，因此可以通过ctDNA识别转移性患者中的靶向突变，研究潜在的靶向治疗方法。SOLAR-1 研究使用组织样本和 ctDNA 确定 PIK3CA 突变状态，研究显示对于那些接受Alpelisib 联合氟维司群的ctDNA鉴定的PIK3CA突变患者，疾病进展或死亡风险降低了45%。因此，FDA批准了PIK3CA基因突变检测试剂，用于乳腺癌靶向药物 Alpelisib的组织和血浆ctDNA 伴随诊断。并且NCCN指南建议对HR+/HER2-阴性患者的肿瘤组织样本或 ctDNA 进行PIK3CA突变检测。 循环miRNA microRNA（miRNA）在基因表达的转录后调控中发挥关键作用，并参与细胞的增殖、分化、凋亡和代谢。因此，miRNA的失调与癌症有关。循环miRNA可以作为生物标志物，帮助我们监测疾病过程。目前已经对各种miRNA类型和panel做了大量研究，以确定它们在乳腺癌中是否具有预后意义。例如，Kleivi Sahlberg等人发现了与原发性TNBC患者复发和OS相关的4个miRNA标记（miR-18b、miR-103、miR-107和miR-652）。另一项研究证明，循环miR-34a的表达增加与肿瘤分期相关，miR-10b、miR-34a和miR-155的上调与转移性疾病相关。令人兴奋的是，通过机器学习模型选择的循环miRNA panel已经被开发用于众多实体瘤恶性肿瘤的早期检测，并且证明在乳腺癌中的灵敏度为91%，特异性为90%。这进一步证明了液体活检结合机器学习的强大潜力。 临床实践 目前各指南对生物标志物的临床使用建议如下图所示： 美国国立综合癌症网络（NCCN）和美国临床肿瘤学会（ASCO）指南建议在转移性疾病中连续监测CEA、CA15-3和/或CA27-29，任何标志物升高20%-30%可提示治疗失败。欧洲肿瘤内科学会（ESMO）、国家临床生化学院（NACB）、欧洲乳腺学会和欧洲肿瘤标志物组（EGTM）均建议对转移性疾病进行连续的CEA、CA15-3和/或CA27-29测量。 NACB和EGTM建议测量CEA、CA15-3和CA27-29以进行术后监测，即使患者暂未有进展证据。 EGTM建议术前测量CEA或CA15-3/CA27-29并结合已确定的因素，以帮助确定预后。 NCCN指南建议对HR+/HER2-阴性患者的肿瘤组织样本或ctDNA进行PIK3CA突变检测。 总结 生物标志物为乳腺癌患者的预后和治疗反应提供了有价值的参考。血清生物标志物为组织生物标志物提供了一种有吸引力的替代方法，尤其是在监测治疗缓解后疾病复发或进展，以及确定直接治疗的靶向突变方面。 CA15-3、CA27-29和CEA在早期乳腺癌中的敏感性较低，但它们已被证明在转移性疾病的管理中是有用的辅助手段，特别是在通过连续测量监测治疗反应方面。 虽然不能替代组织HER2表达测定，但血清HER2 ECD具有潜力，特别是在HER2不一致的情况下；尽管目前专家组不推荐使用，但HER2 ECD可能提供启动抗HER2治疗决定的额外信息，需要进一步研究。 GP88直接参与肿瘤发生，可提供有意义的预后和预测信息，尤其是在转移性疾病中。需要对其进行更深入的研究，包括作为生物标志物和治疗靶点，但它证明了参与肿瘤形成各个阶段的新型生物标志物在肿瘤学中很有前景。 生物标志物研究的另一个令人兴奋的途径在于液体活检。CTC是最确定的，且最有前景的预后和预测工具，但目前的证据限制了其广泛应用。然而，即将进行的试验如DETECT试验将试图解决这些局限性，尤其是在监测转移性疾病的治疗方面。ccfDNA和ctDNA有许多应用，从辅助诊断ccfDNA甲基化到用ctDNA确定可操作基因的突变状态。最后，循环 miRNA panel 在包括乳腺癌在内的所有癌症中都具有预后和预测潜力，但在广泛临床应用之前需要进一步研究。 许多正在进行的研究都会将系列生物标志物指导的疾病监测方法与传统监测方法进行比较。这非常必要，并且可能潜在改变所有类型实体瘤中成像驱动的缓解评估。再者，通过液体活检和机器学习的结合，个性化医疗可以更容易地整合到标准治疗中。 目前乳腺癌生物标志物相关领域研究持续增长，但遗憾的是，很少有生物标志物抵达终点线，成为乳腺癌临床管理的标准方案，期待后续研究能够有所突破。 参考文献： https://doi.org/10.1016/j.clbc.2021.09.006.
